Введение

Гиалуроновая кислота (ГК) является линейным поли­сахаридом, состоящим из повторяющихся дисахаридных участков глюкуроновой кислоты и N-ацетил. В отличие от других гликозаминогликанов (например, дерматансульфата или кератинсульфата), ГК не содержит серы. Гиалуроновая кислота является одним из важных ком­понентов межклеточного матрикса, в который «встрое­ны» клетки и упругие волокна матрикса — коллаген и эластин. Другим уникальным свойством ГК является ее высокая способность связывать воду. В растворе ГК на­ходится в пластичном, спиралеобразном состоянии, что позволяет ей связывать воду. Благодаря данному свой­ству, ГК играет важную роль в поддержании гомеостаза межклеточного пространства и принимает участие в ре­гулировании обмена межклеточной жидкости.

Недавние исследования показали, что ГК участвует в процессах тканевой регенерации, интегрируясь в матрич­ные структуры, поддерживая целостность и баланс компо­нентов матрикса при деградации и реконструкции, обеспе­чивая нормальный жизненный тонус кожного покрова и восстановление его после повреждения. Эти свойства делают ГК важным компонентом косметических средств, в которых она может использоваться для разглаживания морщин или устранения антивозрастных явлений.

Существенным ограничением при косметическом применении ГК является ее большая молекулярная мас­са, которая может доходить до 2 млн Да. Тем не менее небольшие фрагменты могут проникать через кожный барьер (особенно, если он поврежден или ослаблен). Не­давние исследования показали, что фрагменты ГК с мо­лекулярной массой менее 20 кДа могут связываться с так называемыми Толл-подобными рецепторами (TLRs) 2-го и 4-го типа и активировать клетки, что в конечном итоге приводит к выделению медиаторов воспаления. Таким образом, целью настоящего исследования было определить тот оптимальный молекулярный размер ГК, при котором, с одной стороны, она оказывала выражен­ное антивозрастное и увлажняющее действие, а с другой, не вызывала негативные последствия активации рецеп­торов TLRs и выработки медиаторов, запускающих воспа­лительную реакцию.


Материалы и методы

Оценка диффузии ГК

Диффузию гиалуроновой кислоты молекулярной массой 50, 300, 800 и 1500 кДа исследовали на дерматоме кожи свиного уха с использованием диффузионной ячейки Франца [п]. Молекулы ГК «метили» радиоактив­ным тритием.

Методика исследования заключается в следующем: у 5-месячной свиньи забирают кусочек неповрежденной кожи с уха, затем дерматомом срезают образец кожи для испытаний толщиной около 750 микрометров, используя аппарат Acculan GA 643 (Aesculap, Германия). Образцы помещают в модифицированные ячейки Франца для ис­следования чрескожного проникновения таким образом, чтобы внешняя поверхность (роговой слой) была обра­щена к донорской камере.
Через 5 и 22 ч экспозиции определяют уровень радио­активности (в нг×см-2/ч), который принимают за параметр чрескожной диффузии.

Клеточная культура

Реконструированный человеческий эпидермис (про­изводство SkinEthic, Франция) инкубировали до начала эксперимента при температуре 37 °С и содержании СО2 около 5 %. Перед исследователями стояла задача исключить ве­роятный провоспалительный эффект, вызванный низ­комолекулярной фракцией гиалуроновой кислоты. Для этого реконструированный человеческий эпидермис помещали на 48 ч в о,5 % водный раствор ГК (производство Novozymes, Дания) в концентрации 20, 50, 130 или 320 кДа.
Другой задачей исследования было выявление внеш­них характерных эффектов ГК, и с этой целью на поверх­ность образцов реконструированного человеческого эпидермиса наносили 50 мкл 0,5 % водного раствор ГК в концентрации 50 или 8оо кДа ГК и оставляли на 48 ч.

Выделение РНК

Общую РНК выделяли из опытных образцов клеток кожи с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в порядке, описанном в инструкции к данному набору.
Концентрацию РНК определяли методом спектроско­пии на приборе SmartSpec Plus (Biorad, Германия).
Гомогенность и целостность РНК исследовали на био­анализаторе Agilent 2100 с набором реагентов 6000 Nano LabChip (Agilent Technologies.CLUA).
Образцы РНК хранили до анализа при температу­ре -80 С.

ДНК-микропанельное исследование и анализ данных

Экспрессию генов определяли с использованием приборов Affymetrix HGU133 и 2.0 GeneChips (Affymetrix, США), для анализа брали 2 мкг РНК собранного из трех образцов реконструированной человеческой кожи. Вы­деление генов и первичный анализ проводили по ранее описанной методике.

Метод RT-PCR (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой)

Обратная транскрипция (RT) производилась с помо­щью набора First-Strand-cDNA Synthesis Kit (Super Script III, Invitrogen, USA) с 100 нгочищенной РНК, забранной из каждого образца. Транскрипция осуществлялась соглас­но инструкции по использованию набора.
Количественный ПЦР-анализ производился на аппара­те Opticon DNA engine (MJ Research Software, Германия).

Исследование in vivo

In vivo эффекты различных по массе молекул ГК (50, 130 и зоо кДа) исследовали в плацебо-контролируемом 8-недельном исследовании с применением крема, содер­жащего водно-жировую эмульсию с 0,1% гиалуронатом натрия.

В эксперименте участвовали 12 женщин-волонтеров в возрасте от 30 до 60 лет. Крем наносили дважды в день в течение 60 дней. После чего анализировали ряд пара­метров шероховатости и микрорельефа кожи с исполь­зованием реплик поверхности кожи (SILFLO Flexico Ltd., Зеликобритания).

В данной методике использовали специальные ди­ски с липкой поверхностью (производство компании ЗМ, США, размеры 24 x 40 мм), которые укрепляли на поверхности кожи волонтеров для того, чтобы ограничить исследуемый участок и предотвратить натяжение кожи во время нанесения полимера. Затем на участок кожи внутри диска наносили небольшое количество полиме­ра, который затвердевал в течение пяти минут. Диск уда­ляли, полученный слепок (реплика) аккуратно снимали и исследовали с помощью специального программного обеспечения (Quantilines, Monaderm, Франция), которое позволяло проводить общий анализ данных ряда пара­метров рельефа кожи в соответствии с методикой, опи­санной Corcuff.


Результаты и обсуждение

На участках воспаления ГК подвергается быстрой де­градации под действием гиалуронидазы, которая в боль­ших количествах вырабатывается клетками, вовлеченны­ми в воспалительный процесс.

Продукты распада ГК активно включаются в про­цессы повреждения и репарации, так как доказано, что они активируют прововоспалительную деятельность ма­крофагов, дендритных клеток (клетки Лангерганса), активируя в них синтез медиаторов воспаления и ферментов, разрушающих межклеточный матрикс. Недавние иссле­дования выявили, что связывание фрагментов распада ГК рецептором TLR-4 напрямую активизирует клетки, уча­ствующие в воспалительной реакции (на стадии миграции и активации макрофагов). Так как на кератиноцитах при­сутствуют рецепторы TLR-4, то возможно, что расщепление ГК на низкомолекулярные фрагменты напрямую связано с опасностью провоцирования воспалительной реакции.

Для определения порога молекулярной массы и раз­мера фрагментов ГК, при котором начинает проявляться их прововоспалительный эффект, образцы кожи поме­щали в растворы ГК с разным весом (20, 50, 130 и 300 кДа). Как индикатор, при котором срабатывает пусковой меха­низм воспалительного ответа, использовалась экспрес­сия TNF-a. На рис. 1 можно видеть, что молекулы гиалуроновой кислоты с молекулярным весом свыше 50 кДа не проявляют подобных эффектов.

Эти данные позволяют сделать вы­вод о том, что в воспалительной реакции кератиноциты играют вспомогательную роль не только за счет продук­ции различных цитокинов, таких как TNF-a. Согласно по­лученным результатам, ГК с молекулярным весом менее го кДа не может применяться из-за риска развития воспа­ления, тогда как применение ГК с размером 50 кДа с этой точки зрения уже является безопасным (рис. 1).

После определения наименьшего молекулярного размера молекулы ГК, при котором не запускается пу­сковой механизм воспалительной реакции, следующим шагом эксперимента было исследование воздействия ГК на кератиноциты на генном уровне. Для этих целей ГК с молекулярной массой 50 кДа наносили на реконструиро­ванный человеческий эпидермис на срок 48 часов. Далее экстрагировали РНК для транскриптивного анализа с ис­пользованием микрочиповой технологии. Для сравнения г тот же эксперимент проводили с ГК массой 800 кДа, кото­рая широко применяется в настоящее время в косметологии в качестве увлажняющего ингредиента в косметиче­ских средствах.

По сравнению с ГК массой 800 кДа, которая индуцирует экспрессию 40 генов, гиалуроновая кислота с массой 50 кДа воздействует уже на 120 генов, включая гены, играющие ключевую роль в регуляции жизнедеятельности кератиноцитов, например гены, регулирующие экспрессию белков, отвечающих за межклеточные кон­такты (рис. 2).

Воспалительная реакция в этом опыте не наблюдалась.
Отдельно был проведен эксперимент по изучению проникающих свойств ГК разной молекулярной массы — 50, 300, 800 и 1500 кДа (рис.3). Было показано, что пенетрация низкомолекулярной гиалуроновой кислоты с массой 50 кДа после 5-часовой экспозиции была по к меньшей мере в три раза выше по сравнению с пентрацией ГК массой 300 кДа. Эти результаты убедительно г доказывают, что существует зависимость трансэпидермального транспорта ГК от ее молекулярного веса, и к низкомолекулярные фракции проникают в кожу значительно лучше.





Исследования in vitro показывают, что ГК с массой 50 кДа проникает через кожу намного лучше, нежели чем ГК с массой 800 кДа и активизирует большее количестве рецепторов. Для того чтобы изучить, как эти in vitro эффекты проявляются в условиях in vivo, мы провели8-недельный плацебо-контролируемый эксперимент с тремя фракциями гиалуроновой кислоты разной массы Исследование показало, что ГК с массой 50 кДа не только значительно снижает шероховатость кожного покрова (рис. 4 а-в), но и обладает выраженным эффектом раз­глаживания морщин (рис. 4 г-д). Более того, этот эффект больше выражен у ГК с массой 50 кДа по сравнению ГН массой 800 кДа, которая не показала такого эффекта, но широко используется благодаря очень хорошим увлаж­няющим свойствам.










Заключение

В результате настоящего исследования было убеди­тельно доказано, что ГК не просто обладает полезными для кожи свойствами, но эти свойства могут контролиро­ваться за счет применения ГК различного молекулярного веса.
Было доказано, что низкомолекулярная гиалуроновая кислота лучше транспортируется через кожный покров, нежели чем ГК с высокой молекулярной массой, а также активирует большее количество генов кератиноцитов, включая гены, отвечающие за дифференцировку кера­тиноцитов и формирование комплексов межклеточных контактов, количество которых снижается в фотоповрежденной и стареющей коже.
Эти молекулярные эффекты ГК определяют и раз­личия в проявлении in vivo эффектов. В исследовании было показано, что увлажняющий эффект и повышение эластичности кожи в большей мере свойственны ГК с высокой молекулярной массой, тогда как разглаживающий эффект продемонстрировала ГК с низкой молекулярной массой.
Увеличение активности при снижении молекулярного веса гиалуроновой кислоты может объясняться повыше­нием трансэпидермального проникновения для молекул ГК меньшего размера.
Исследование впервые показало, что аппликация низкомолекурной ГК приводит к активизации физиологиче­ских процессов кожи и получению омолаживающего эф­фекта, который может быть достигнут за счет повышения проницаемости и уменьшения молекулярной массы.